彗星試驗需要注意的事項

　　其原理是器官或組織經(jīng)處理（如輻射、重金屬等）后，細胞中的DNA發(fā)生單鏈或雙鏈斷裂，經(jīng)細胞及其核膜裂解后，DNA解旋，在電場作用下，DNA 斷片遷移出細胞核，形成彗星狀的電泳圖譜。正常細胞的大分子DNA在電場作用下遷移距離較短，DNA仍保留在細胞核的范圍，形成圓形或輕微拖尾的圖譜。根據(jù)電泳緩沖液的pH值不同，可分為中性彗星實驗（pH=8.4）和堿性彗星實驗（pH＞13）。中性彗星實驗主要用于檢測DNA雙鏈的斷裂損傷，堿性彗星實驗具有更高的靈敏性，可用于檢測更少量的單鏈和雙鏈斷裂損傷。

　　需要注意的是：

　　1、細胞一定要消化成單個的，如果待測的細胞是懸浮生長的，或者形狀是圓形的，可以直接用細胞刮收細胞做，如果細胞是非圓形的，例如成纖維細胞等，一定要用胰酶消化，使之成圓形，然后才可做實驗。很多做彗星實驗總是出不來結(jié)果的，可以考慮下是否是這方面的原因。

　　2、細胞裂解：裂解條件也是一個關(guān)鍵變量，可能會干擾特定類型的DNA修飾(某些DNA烷基化和堿基內(nèi)收)導(dǎo)致的鏈斷裂。因此建議在實驗中對所有玻片的裂解條件盡可能保持恒定。準備好后，應(yīng)在約2-8攝氏度的弱光條件下(如黃光(或防光)，將載玻片浸入冷凍溶解液中至少1小時(或過夜)，以避免暴露在可能含有紫外線成分的白光下。在此潛伏期之后，在堿液展開步驟之前，應(yīng)沖洗載玻片以除去殘留的洗滌劑和鹽。這可以用純凈水、中和緩沖液或磷酸鹽緩沖液來完成。

　　3、電泳時，電流與電壓強度在每次實驗時要恒定，這樣出來的慧尾才有分析價值，將載玻片隨機放置在含有足夠電泳溶液的潛電泳裝置的平臺上，使載玻片表面全部覆蓋(每次覆蓋的深度也應(yīng)一致)。

　　4、玻片準備：單細胞懸液制備后，應(yīng)盡快(最好在1小時內(nèi))制備載玻片，但動物死亡與載玻片制備之間的溫度和時間應(yīng)嚴格控制，并在實驗室條件下進行驗證。

　　5、掉膠的問題：蓋玻片最好兩面都涂上剝離硅烷(挺便宜的一大瓶，但是有毒)，這樣會好很多

　　6、電泳膠使用時需提前水浴融化，禁用微波，清洗玻片時注意不要直接將液體傾倒至膠面，防止脫膠。

　　7、使用組織進行彗星試驗時，需注意細胞制備需全程在冰上進行，且保證在1小時內(nèi)完成鋪片。

　　8、測量方法：彗星應(yīng)該使用自動化或半自動化的圖像分析系統(tǒng)進行定量評分。用合適的熒光染色劑對載玻片進行染色，并在配備有超熒光和適當檢測器的顯微鏡或數(shù)碼相機上進行適當放大(如200x)的測量。